jinnian金年会官方网站入口·贵州中医药大学：基于网药和分子对接探讨苗药土大黄防

　　功能失调性子宫出血（DUB ）又称功能性子宫出血或功血，是由于下丘脑 – 垂体 – 卵巢轴异常引起神经内分泌功能失调，影响体内雌孕激素水平，导致的非正常子宫出血 [1] 。DUB 是一种临床常见妇科疾病，占10% ～15% ，50% 发生在更年期，30% 发生在生育期，20% 发生在青春期。目前临床治疗 DUB 以止血为主要目标，常用的办法是刮宫加激素治疗，通过刮宫达到快速止血的目的 [2] ，辅以对患者内分泌的调理，在疗效和康复方面不能令人满意，只能暂时性地压制临床症状的发展或者恶化，常因防治不彻底导致复发，因此亟需疗效确切的治疗药物 。

　　苗药土大黄为蓼科植物尼泊尔酸模 Rumex nepalensis Spreng. 、齿果酸模 Rumex dentatus L. 或羊蹄 Rumex japonicus Houtt. 的新鲜或干燥根及根茎，苗药名“锐马欲”。药用始载于《神农本草经》：“味苦，寒；主头秃疥瘙，除热女子阴蚀”。贵州少数民族及民间应用较多，2022 年7 月被收载于贵州苗族等少数民族药材目录（第一批）。苗药土大黄味苦，性寒，具有清热解毒、止血收敛、杀菌止痒的功效，临床用于防治热型痰、黄疸、便秘、疥疮、疥癣和多种出血症等疾病 [3-4] ，对 DUB 有独特的防治作用 [5] 。 土大黄主要化合物包括蒽醌类、黄酮类、二苯乙烯类、萘及萘醌类成分 [4] 。目前，对于土大黄防治DUB 研究及作用机制研究比较欠缺。本研究采用网络药理学结合分子对接技术初步探索土大黄对DUB 的防治作用和可能的作用机制，筛选并获得土大黄防治DUB 的有效活性成分及作用靶点，为其后续研究提供参考。

　　以“dysfunctional uterine bleeding ”为检索词，利用GeneCards 数据库（）获取DUB 相关靶点，依据“Relevance score ≥10 ”进行筛选，在OMIM 数据库（）、DisGeNet 数据库（）、DrugBank 数据库（）中再次搜索DUB 获得与其相关的靶点；将挖掘得到的DUB 相关靶点与土大黄靶点导入Venny 2.1.0 （）中进行匹配映射，获得两者交集靶点即土大黄防治DUB 的关键作用靶点。将交集靶点导入String 数据库（）中，构建蛋白相互作用网络（PPI ），蛋白物种设置为“Homo sapiens ”，最低相互作用阈值设置为“high confidence ＞0.900 ”，并隐藏游离的靶标，其余参数保持默认设置，进而得到土大黄防治DUB 的PPI 网络。

　　将PPI 网络图下载TSV 格式并上传至Cytoscape 3.8.2 软件，利用“Analyze Network ”功能拓扑分析，使用度值、介值中心度、紧密中心度3 个拓扑参数同时满足排名前10 作为筛选条件，筛选出核心靶点。

　　将预测的土大黄靶点、药物活性成分、土大黄–DUB 交集靶点导入Cytoscape3.8.2 软件中，绘制“土大黄–活性成分–共有靶点”网络。利用“Analyze Network ”功能进行拓扑分析，使用度值、介值中心度、紧密中心度3 个拓扑参数同时满足排名前10 作为筛选条件，筛选出核心活性成分。

　　使用DAVID 数据库（）对共有靶点核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析，GO 生物功能分析主要包括生物过程（BP ）、细胞组分（ CC ）以及分子功能（ MF ），将这 3 组数据以 P ＜0.01 的条件分别进行筛选，并各取前10 个条目，即组成30 个条目在“微生信”在线绘图工具中制成柱状图进行可视化；KEGG 富集分析筛选出 P ＜0.01 的条目，将前20 条通路制成气泡图进行可视化。

　　在PubChem （）数据库中下载关键活性成分3D 结构的SDF 格式，然后使用openbabel 软件将化合物的SDF 格式转化为PDB 格式，导入Autodock Tools 1.5.7 软件中加氢后导出为pdbqt 文件。在PBD （）数据库中下载核心靶点蛋白文件，使用 Pymol 软件去除水分子与配体，使用 AutoDock TOOLs 1.5.7 软件进行加氢后导出 pdbqt 文件。最后，将所得到的配体小分子和受体大分子一起导入 Autodock Tools 1.5.7 软件中，计算得到相应的结合能数据。使用 Pymol 软件绘制土大黄关键活性成分与核心靶点蛋白之间的模式图，将关键活性成分与各自对应打分最高的核心靶点分子对接进行可视化 。

　　查阅文献获得土大黄相关活性成分45 个，通过Swiss ADME 和Swiss Target Prediction 平台预测后得到符合条件的活性成分26 个，见表1 。共1 173 个靶点，去除重复值得到392 个潜在靶点。

　　通过DisGeNet 数据库、DrugBank 数据库、GeneCard 数据库和OMIM 数据库搜索DUB 相关的疾病基因，最后得出DisGeNet 数据库17 个基因，DrugBank 数据库52 个基因，GeneCard 数据库348 基因、OMIM 数据库50 个基因，共得到467 个基因疾病靶点，删除重复值，获得DUB 相关基因疾病靶点436 个。使用Venny 2.1.0 平台对392 个土大黄药物靶点与436 个疾病靶点进行互相映射，共获得交集靶点74 个。

　　将得到的土大黄与 DUB 74 个共有基因导入 STRING 数据库进行蛋白相互作用分析，结果显示，网络共包含 74 个节点， 206 条边，平均节点度值为 5.57 。保存其 TSV 格式导入到 Cystoscape 3.8.2 中进行拓扑分析，见图 1 。共获得 62 个节点和 218 条节点之间的连线 个游离靶点）。图中节点的大小和颜色根据度值来显示，度值越大，节点越大颜色越深，即靶点的作用越重要。根据度值、介值中心度、紧密中心度同时排名前 10 位，筛选出 7 个核心靶点 ，分别为 STAT3 、 src、 PIK3R1 、 PIK3CA 、 ESR1 、 AKT1 、 RELA ，其拓扑分析结果见表 2 。

　　将土大黄及 26 个活性成分， 74 个关键靶点导入 Cytoscape 3.8.2 软件中构建“土大黄–活性成分– 共有靶点”网络图，见图 2 。图包括 101 个节点（ 74 个圆形节点为核心靶点， 26 个菱形节点活性成分， 1 个六边形节点为苗药土大黄）， 278 条边。利用“ Analyze Network ”功能进行拓扑分析，度值、介值中心度、紧密中心度同时排名前 10 位的核心活性成分有 9 个，分别为槲皮素、阿魏酸、豆蔻酸、羟基大黄素、决明柯酮、大黄素甲醚、委陵菜酸、大黄酚、 3,4- 二羟基苯甲酸乙酯，其拓扑分析结果见表3 。

　　通过David 数据平台进行KEGG 富集分析，得到122 条信号通路（ P ＜0.01 ），选取排名前20 的通路进行可视化处理，绘制KEGG 信号通路气泡图，见图4 。结果显示，土大黄有效成分防治DUB 的潜在靶点主要涉及HIF-1 、PI3K-Akt 等信号通路。

　　近年来，DUB 患者逐渐增多，不仅会影响患者的生活与工作，重者还会由于出血过多导致休克危及生命安全，引起了社会和临床的广泛关注，且目前DUB 的病因和发病机制尚未完全明确。现代医学认为DUB 主要与患者精神过度紧张、劳累、营养不良或代谢紊乱、环境及气候改变有关，或与卵巢或黄体等因素所导致的内分泌紊乱有关，进而引起子宫出血的症状 [7] 。现在常用手术加激素治疗，存在子宫内膜会变薄和药物不良反应多等缺点，不能从根本上消除导致子宫异常出血的病因 [8] 。中医学认为，DUB 属于“崩漏”的范畴，《诸病源候论》指出“冲任之脉虚损，不能约制其经血，故血非时而下”，其主要病机是冲任不固，不能制约经血，使子宫藏泻失常 [9] ，特点多为虚实夹杂，血热、血虚、血瘀并存，故治法当凉血、补血、活血并用，才能冲任得固，血海得充，达到血归其经的目的 [10] 。土大黄属于清热药，其主要用于因血分中有热而致的多种出血症，经过民间多年应用及临床研究证明苗药土大黄防治DUB 有特效 [11] ，但其作用机制尚无系统性研究。

　　献查阅并进行筛选后得到土大黄防治 DUB 主要活性成分26 种，最后筛选出大黄酚和槲皮素等9 种土大黄防治DUB 关键活性成分。有学者研究发现，大黄酚口服或皮下注射，可缩短血液凝固时间，具有止血作用，降低毛细血管的通透性，改善血管脆性，缩短凝血时间等 [12] ；大黄酚及大黄素通过干扰三磷酸肌醇（IP3 ）诱导的钙释放机制，对激动剂诱导的血管收缩均有明显的抑制作用 [13] 。槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等药理活性 [14] ，可以通过改变细胞周期进程、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制血管扩张，发挥抗肿瘤作用 [15] 。研究表明，槲皮素止血作用的增强与含量的增加有关 [16] ， 还能靶向抑制核因子-κB 信号通路转导作用于SRC ，发挥抗炎活性 [17] 。此外，槲皮素还能通过激活蛋白激酶B （Akt ）磷酸化，作用于磷脂酰肌醇3- 激酶（PI3K ）/Akt 信号通路，减少氧化应激，实现对血管内皮细胞的修复和保护作用 [18] 。由此进一步探讨土大黄主要活性成分防治DUB 的作用机制，PPI 分析显示，土大黄可能与STAT3 、SRC 、PIK3R1 、PIK3CA 、ESR1 、AKT1 、RELA 等多个靶点产生协同作用，这些靶点分别通过调控炎症反应、激素合成、增殖与凋亡来有效控制子宫出血 [19] 。其中，AKT1 是PI3K-Akt 信号通路的下游蛋白，在血小板的活化中起关键作用，其作为Akt 的亚型，可参与代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等多种生物学过程。实验研究表明，AKT1 基因缺陷小鼠与正常鼠相比，其出血时间增加，凝血时间延长，且血小板聚集、分泌和扩散受损 [20] 。STAT3 属于STAT 家族成员之一，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起着关键作用，可促进促血管生成的关键调节信号的生成，介导细胞的生长、凋亡等过程 [21] ，是一种参与肿瘤发生和组织损伤的常见信号传导机制，能够参与调节伤口愈合和癌症，包括细胞侵袭和迁移、血管生成、凝血调节和干扰素诱导基因的抑制 [22] 。研究表。